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細胞實(shí)驗必備技能——細胞計數
發(fā)布時(shí)間:2023.05.01 瀏覽數:2160
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細胞計數是細胞培養過(guò)程中的重要步驟,“金標準細胞計數方法”是在顯微鏡下使用血細胞計數板人工計數。這里博大博聚給大家介紹下金標準細胞計數的詳細的步驟,供大家參考。

 

1、準備好血細胞計數板

1) 先用無(wú)水乙醇清潔血細胞計數板表面和蓋玻片;

2) 再用純水清潔血細胞計數板表面和蓋玻片;

3) 每次清洗后用洗耳球吹干。

4) 在血細胞計數板的計數池上方蓋上專(zhuān)用的蓋玻片。

注意:最好不要擦拭血細胞計數板的計數池,防止標識線(xiàn)損壞。

 

2、制備細胞懸液

1) 貼壁生長(cháng)的細胞,使用胰酶消化的方法使細胞從培養瓶表面脫落;

2) 漩渦混勻或使用移液器反復吹吸細胞懸液,盡量減少細胞團簇;

3) 懸浮細胞則可以直接進(jìn)行取樣計數;

4) 細胞懸液的計數濃度:5×105個(gè)細胞/m L -5×106個(gè)細胞/m L。

注意:

a) 盡量少、盡量小的細胞團簇; 

b) 如需計算活率,則需將細胞懸液按照1:1的比例加入等量的0.4%的臺盼藍染料,混勻后,靜置1~2分鐘。  
    

3、細胞加樣

1) 移液器輕吹細胞懸液使其混合均勻;

2) 將細胞懸液與臺盼藍染料按1:1體積混合均勻;

3) 取出10uL細胞懸液,將細胞懸液滴加于血細胞計數板邊緣凹槽處,此時(shí)液滴將在虹吸的作用下進(jìn)入蓋玻片下方的計數池。

注意:

1) 每次加樣前要混勻細胞懸液,防止細胞沉降造成取樣誤差增大;

2) 加樣過(guò)程中,要一次性將細胞懸液注入計數室,防止氣泡產(chǎn)生,否則要重做;

3) 加樣時(shí)不要將細胞懸液直接吹入計數池,會(huì )造成細胞分布不均勻。

 

4、 人工細胞計數

計數工具:10X物鏡的顯微鏡、血細胞計數板。

1) 加樣后,將血細胞計數板靜置數分鐘;

2) 把血細胞計數板放置在顯微鏡的載物臺進(jìn)行觀(guān)察-計數-記錄;

3) 分別計數大方格1-2-3-4中的細胞總數。

 

注意:

1) 計數時(shí)建議重復1-2次,取平均值,減小計數誤差;

2) 四個(gè)區域的細胞數量偏差不應超過(guò) 5%,否則要重新加樣。

3) 對橫跨刻度上的細胞,依照“數上不數下,數左不數右”的原則進(jìn)行計數。

4) 為降低細胞計數誤差,濃度最好控制在5×105個(gè)細胞/ml以上(每個(gè)大方格有50個(gè)以上細胞);

5) 計數時(shí),只計數完整的細胞,如有聚團細胞則按一個(gè)細胞進(jìn)行計數。

 

5、 血細胞計數板濃度計數標準

(中國的標準:JJG 552-1988血細胞計數板試行檢定規程)

1) 如上圖所示,當血細胞計數板放上蓋玻片后,平臺與蓋玻片之間的距離 (即高度)為 0.1mm;

2) 平臺中心部分各以3mm長(cháng),3mm寬精確劃分為9個(gè)大方格,稱(chēng)為計數室,每個(gè)大方格面積為1mm2,體積為 0.1mm3;

3) 細胞濃度 (mL)=(四個(gè)大方格細胞數之和)/4X2(染液稀釋倍數)X 104=?個(gè)細胞/mL。

    注意:

1) 如果不加入臺盼藍染料,則無(wú)需乘以2。

 

相信有些小伙伴,即使花費很長(cháng)時(shí)間熟悉,并實(shí)際接觸細胞計數操作的全部流程后,還是會(huì )有結果不滿(mǎn)意、人工操作效率低、結果無(wú)法一目了然、細胞計數數到“眼疼”的情況。

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7、血細胞計數板上機實(shí)拍圖案例

 

8、細胞計數結果包括

總細胞濃度、活/死細胞濃度、活/死細胞比率、總細胞聚團率/濃度、活細胞聚團率/濃度、死細胞聚團率/濃度等計數結果、原始圖片、識別圖片、柱狀圖、散點(diǎn)圖、等高線(xiàn)圖、報告單等…

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